卡西波肉瘤是一種發(fā)生在包括口腔在內的多種組織內的，具有極強的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤。卡西波肉瘤KS已經被鑒定出多種細胞標記物，但是其來源依然是一個迷。美國的科學家之前發(fā)現(xiàn)卡西波肉瘤相關的皰疹*（KSHV）能夠使大鼠的原代間充質干細胞（MSCs）感染，變形，并且重新編輯，使其分化為類卡西波肉瘤細胞。在這次的實驗中，科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質干細胞，包括骨髓（MSCbm），脂肪組織（MSCa），牙髓，牙齦組織（GMSC），和乳牙。科研人員成功的建立起來KSHV感染的MSCa，MSCbm和GMSC（LTC-KMSCs）的穩(wěn)定株。其中，這些細胞表達了混合的KS標記物，并且顯現(xiàn)出不同的血管生成、侵襲和變形的現(xiàn)象，而LTC-KMSCs表現(xiàn)出比未感染細胞更低的增殖率。進而研究人員發(fā)現(xiàn)KSHV介導的血管生成是通過KSHV介導的microRNA激活了AKT通路。這些研究說明，在人體內MSCs是KSHV的靶細胞，會建立起多種KSHV感染的模型。
研究人員采用各種MSCs，鋪在基質膠上，孵育8小時，對比不同細胞的分枝數和節(jié)點數。
Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857
（一）實驗材料和實驗方法
1）細胞： MSCs ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)
2）培養(yǎng)基： MSC medium (MSCM; ScienCell Research Laboratories)
3）基質膠： Matrigel Basement membrane (BD) 10 µl per well
4）耗材： ibidi血管生成載玻片 (ibidi, 81506)
5）其他： 細格紙
（二）實驗步驟
1）準備基質膠
① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內孔中，注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。
② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
③ 準備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
⑤ 37℃至少孵育30分鐘，使基質膠完全固化。
怎么知道加了合適體積的Matrigel：
由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。
如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
3）鋪細胞
① 每孔種10000個細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。
② 將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
③ 每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
④ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
⑤ 蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。
4）采集圖像并統(tǒng)計結果
37度 5% CO2孵育8小時后，使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像，并其分枝數和節(jié)點數進行測量和統(tǒng)計。
三）實驗結果
對比LTC-KMSCs幾種細胞的成管效果。Mock是未被*感染的間充質干細胞，KSHV會增強血管形成效果。圖像是鋪細胞后8小時采集，100倍放大倍數。
(A)為了研究KSHV相關的miRNA的作用，對比了未被感染MSCs（Mock），感染的MSCs（KSHV）和用10個pre-miRNA簇缺失的突變*感染的MSCs（ΔmiR）和用這一突變的KSHV穩(wěn)轉的MSCs（ΔmiR Vector）；以及用逆轉錄*重新表達這10個miRNA簇（ΔmiR Cluster）這幾組細胞的血管生成。發(fā)現(xiàn)這幾個miRNA對于細胞的血管形成有著非常重要的作用。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的抑制劑，對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用。并且隨著LY294002濃度的上升，抑制作用會增強。兩組結果均是鋪細胞8小時后以100倍放大倍數采集圖像。
怎么知道加了合適體積的Matrigel：由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。
如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
3）鋪細胞① 每孔種10000個細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。② 將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。③ 每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。④ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。⑤ 蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。
4）采集圖像并統(tǒng)計結果37度 5% CO2孵育8小時后，使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像，并其分枝數和節(jié)點數進行測量和統(tǒng)計。三）實驗結果
對比LTC-KMSCs幾種細胞的成管效果。Mock是未被*感染的間充質干細胞，KSHV會增強血管形成效果。圖像是鋪細胞后8小時采集，100倍放大倍數。
(A)為了研究KSHV相關的miRNA的作用，對比了未被感染MSCs（Mock），感染的MSCs（KSHV）和用10個pre-miRNA簇缺失的突變*感染的MSCs（ΔmiR）和用這一突變的KSHV穩(wěn)轉的MSCs（ΔmiR Vector）；以及用逆轉錄*重新表達這10個miRNA簇（ΔmiR Cluster）這幾組細胞的血管生成。發(fā)現(xiàn)這幾個miRNA對于細胞的血管形成有著非常重要的作用。(B) LY294002一種磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的抑制劑，對于LTC-KMSCa血管形成有明顯的抑制作用。并且隨著LY294002濃度的上升，抑制作用會增強。兩組結果均是鋪細胞8小時后以100倍放大倍數采集圖像。
