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技術(shù)文章
鈣離子Ca2+成像--RacPLCγ2顯著增強了B細胞受體介導(dǎo)的Ca2+活動

2016-05-23 13:12:43 來源：
在生物有機體內(nèi)，鈣離子傳遞了各種各樣的胞內(nèi)信號，這些信號幾乎在每種類型的細胞中都存在，而且在很多方面都有非常重要的作用。在很多細胞活動的時候，胞內(nèi)鈣離子的濃度會顯著升高。鈣離子成像是利用鈣離子特異染料，將細胞中的鈣離子濃度通過熒光強度表現(xiàn)出來，從而達到檢測細胞活動的目的。德國的科學(xué)家通過研究B細胞胞質(zhì)中鈣離子濃度來研究 Rho GTPase Rac 對于B細胞功能的重要影響，研究發(fā)現(xiàn)，RacPLCγ2可以通過增強胞漿內(nèi)的Ca2+濃度來影響B細胞受體（BCR）發(fā)揮作用。

文中，研究人員用BCR和Ca2+分別處理DT40 Bcell，觀測DT40B cell中鈣離子的濃度變化。研究人員研究了在這樣的處理下，Unmodified DT40 cells ( PLCγ2+/+), PLCγ2-/- cells，PLCγ2-/- cells stably expressing wild-type 這幾種細胞的鈣離子濃度變化，說明了PLCγ2，Ca2+和BCR之間的關(guān)系。

Rac-mediated stimulation of phospholipase C-gamma-2 amplifies B cell receptor-induced calcium signaling
C. Walliser, K. Tron, K. Clauß, O. Gutman, A. Kobitski, M. Retlich, A. Schade, C. Röcker, Y. Henis, G. Nienhaus and P. Gierschik
Journal of Biological Chemistry, 2015, 10.1074/jbc.M115.645739

實驗材料：

DT40 B細胞

Poly-L-Lysine          0.01%（w/v)

Fluo-4 AM             2μM

Pluronic F-127        0.02%（v/v）

RPMI 1640

Buffer B         20 mM Hepes/NaOH, pH 7.4；143 mM NaCl；6 mM KCl；1 mM MgSO4；5.6 mM glucose

CaCl2                1mM

六通道載玻片          無包被，德國ibidi公司，80601

圖一：ibidi六通道載玻片，可見載玻片上有六個平行通道，可以做六組平行實驗。或者用不同的樣本。通道載玻片的特點是單通道容積很小，需要的試劑量只有30μl。其底部可以直接使用油鏡，進行高分辨率成像，光學(xué)效果極佳。本文中，是使用共聚焦顯微鏡觀測鈣離子染料的熒光值。

實驗步驟

使用0.01%（w/v)的多聚L賴氨酸（Poly L-Lysine）對六通道載玻片進行包被

單通道鋪入3×105 DT40 B細胞，37℃,10%CO2環(huán)境中孵育45分鐘待細胞貼壁。

使用無細胞培養(yǎng)基，輕輕沖洗通道，移除未貼壁細胞（圖二）。

圖二：沖洗換液方法，藍色代表新的無細胞培養(yǎng)基

用RPMI 1640培養(yǎng)基加入2 µM fluo-4 AM, 0.02 % (v/v)Pluronic® F-127，加入通道中，孵育30分鐘。

用Buffer B沖洗兩次細胞，可以用加入 BCR抗體 anti-IgM或 1 mM CaCl2做為刺激液。

使用共聚焦顯微鏡觀測數(shù)據(jù)。

實驗結(jié)果

圖三：由圖中曲線可以看出，在沒有胞外Ca2+存在的時候，對BCR的刺激（加入 BCR抗體 anti-IgM）和B細胞中鈣離子活動成比。而當(dāng)有胞外Ca2+的時候（加入1mM CaCl2）胞外對于胞內(nèi)鈣離子的活動也有非常顯著的影響，會隨著Anti-IgM的升高，胞內(nèi)鈣離子濃度會降低。
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邵瓊女士

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